Technologia
MOC LIPOSOMÓW
Liposomy to struktury powstające samoistnie z fosfolipidów. Mają postać pęcherzyków o wielkości 0,01-1 μm wypełnionych wodą (lub wodnym roztworem), a otoczonych podwójną warstwą lipidową o grubości ok. 5 nm. Otoczka liposomów jest zbudowana analogicznie do błon biologicznych. Liposomy występują w organizmach żywych, np. we krwi lub w formie sztucznej mogą być produkowane przemysłowo.
UNIKALNE ZASTOSOWANIE
Liposomy wytwarzane sztucznie znajdują zastosowanie głównie w przemyśle farmaceutycznym oraz kosmetycznym, a także w badaniach naukowych, jako model błony biologicznej. Wewnątrz liposomów można umieszczać roztwory lub zawiesiny wodne różnych substancji, w tym także leków lub kwasów nukleinowych. Cecha ta umożliwia stosowanie liposomów jako nośników różnych substancji aktywnych. Zespół badawczy SyVento rozwija zaawansowane systemy nośników substancji aktywnych dedykowanych kosmetykom, suplementom diety i farmaceutykom, które rewolucjonizują efektywność dostarczania substancji czynnych do organizmu człowieka.
W naszym nowoczesnym laboratorium stworzyliśmy w 100% biokompatybilny, biodegradowalny innowacyjny nośnik, który skutecznie poprawia właściwości zamkniętych substancji aktywnych - VECTICELL.
WŁAŚCIWOŚCI NOŚNIKÓW VECTICELL
VECTICELL to nowoczesny system dostarczania substancji czynnych, którego budowa oparta jest na fosfolipidach. Jego wysoką skuteczność gwarantują trzy cechy:
- Kompozycja lipidowa – nośniki VECTICELL są zbudowane z fosfatydylocholiny o standardzie farmaceutycznym, dzięki czemu doskonale wbudowują się w błony komórkowe. Są to cząsteczki w pełni biodegradowalna i biokompatybilna,
- Elastyczna błona nośnika – podwójny lub potrójny system enkapsulacji polegający na pokryciu struktur nośników związkami regulującymi elastyczność warstwy lipidowej gwarantuje wysoką przenikalność między przestrzeniami komórkowymi,
- Homogeniczny rozmiar – technologia kalibracji nośników VECTICELL daje im powtarzalną i programowalną wielkość, co bezpośrednio wpływa na zwiększoną efektywność dotarcia do komórek skóry.
WARTOŚĆ DODANA
Badania potwierdzają, że nośnik VECTICELL z łatwością może być wprowadzany do gotowych formulacji kosmetycznych. Jest odporny na procesy technologiczne – homogenizację, działanie detergentów oraz wysoką temperaturę.
Użycie VECTICELL tworzy wartość dodaną w procesie technologicznym:
- Jako roztwór wodny o wysokim stężeniu substancji aktywnych, jest w 100% mieszalny w wodzie.
- Może być dodawany w ostatniej fazie mieszania formulacji kosmetycznej na zimno, dzięki temu substancje w nim zawarte nie ulegają degradacji.
- Polidyspersyjność VECTICELL nie przekracza 0,3 PDI, co gwarantuje powtarzalność serii.
- W produkcji VECTICELL nie są wykorzystywane żadne agresywne rozpuszczalniki, etanol ani parabeny.
- Cały proces produkcyjny odbywa się w warunkach zgodnych z normą ISO 22716.
DODATKOWE INFORMACJE
NA TEMAT LIPOSOMÓW:
- Liposomy
- Metody otrzymywania liposomów
- Metody zamykania substancji czynnych w liposomach
Liposomy pierwszy raz opisane zostały w Anglii w lata 60-tyh przez Banghama który badał wpływ fosfolipidów na proces krzepnięcia krwi. Zaobserwował on iż w roztworze wodnym fosfolipidy tworzą spontanicznie wielowarstwowe pęcherzykowate struktury zamykające w swym wnętrzu roztwory wodne. Powstałe struktury nazwał liposomami (A. D. Bangham, Standish, & Watkins, 1965).
Tworzenie pęcherzyków lipidowych ( liposomów) z fosfatydylocholiny.
Obecnie liposomy definiujemy jako sztucznie otrzymywane mikroskopijne pęcherzyki lipidowe zbudowane z jednej lub wielu dwuwarstw lipidowych zamykające w swoim wnętrzu roztwór wodny, które zbudowane są głownie z fosfolipidów. Powstawanie liposomów w roztworach wodnych wywołane jest głownie poprzez hydrofobowy efekt, który powoduje organizację amfifilowych fosfolipidów w taki sposób aby zminimalizować efekt entropowy wywołany odziaływaniem hydrofobowych łańcuchów tłuszczowych a otaczającym ich środowiskiem wodnym. Dodatkowo efekt ten jest stabilizowany przez szereg odziaływań elektrostatycznych, wiązań wodorowych czy odziaływań Van der Waalsa (Lasic & Papahadjopoulos, 1995). Dzięki swojej budowie liposomy mogą być wykorzystane zarówno jako nośniki dla substancji hydrofilowych (które mogą być zamykane w hydrofilowym wnętrzu) jak i hydrofobowe w dwuwarstwie lipidowej.
Schematyczna budowa liposomu.
Liposomy można sklasyfikować ze względu na ich rozmiar oraz lamelarność (tj. warstwowość czyli liczbę dwuwarstw, z których zbudowane są liposomy). Oba te parametry są kluczowe gdy mówimy o liposomach jako nośnikach substancji czynnych gdyż odpowiadają one za czas krążenia pęcherzyków w krwioobiegu oraz ilość i dostępność leku. Klasyfikacja liposomów pod względem wielkości i lamelarności wygląda w następujący sposób:
Małe jednowarstwowe pęcherzyki – SUV (ang. small unilamellar vesicles) :20-100nm
Duże jednowarstwowe pęcherzyki – LUV (ang. large unilamellar vesicles) :>100 nm
Olbrzymie jednowarstwowe pęcherzyki – GUV (ang. giant unilamellar vesicles): >1000 nm
Pęcherzyki oligowarstwowe – OLV (ang. oligolamellar vesicles): 100-500 nm
Pęcherzyki wielowarstwowe – MLV (ang. multilamaler vesicles): >500 nm
W roku 2004 dodatkowo opisano liposomy wielopęcherzykowe (MVV z ang. multivesicular vesicles)(Grant et al., 2004).
Klasyfikacja liposomów ze względu na ich wielkość (Laouini A. et al., 2012).
Jak już wspomniano wcześniej głównym składnikiem budulcowym liposomów są naturalne i/lub syntetyczne/semisyntetyczne fosfolipidy takie jak fosfatydylocholina, fosfatydyloetanoloamina czy fosfatydyloglicerol. Distearylofosfatydylocholina i distearylofosfatydyloetanloamina oraz ich pochodne są obecnie jednymi z najczęściej wykorzystywanych fosfolipidów w technologiach liposomowych. Oprócz fosfolipidów błona liposomów może zawierać także inne lipidy pomocnicze takie jak np. cholesterol który wpływa na właściwości dwuwarstwy lipidowej z jednej strony modulując jej płynność a z drugiej zmniejszając przepuszczalność dwuwarstwy dla substancji rozpuszczalnych w wodzie. Do modyfikacji właściwości liposomów stosuje się również szereg koniugatów typu polimer-lipid.
Obecnie istnieje wiele metod pozwalających na otrzymywanie liposomów różniących się od siebie przede wszystkim sposobem w jaki lipidy pozbawia się organicznego rozpuszczalnika oraz sposobu w jaki są one następnie dyspergowane w środowisku wodnym. Poniżej opisano najważniejsze metody otrzymywania liposomów.
1) Metoda uwodnienia cienkiego filmu lipidowego (z ang Thin Film Hydratation – TFH): metoda ta jest najstarszą metodą opisującą wytwarzanie liposomów i oryginalnie została ona zastosowana po raz pierwszy przez Banghama. Metoda ta polega na odparowaniu pod próżnią (najczęściej za pomocą wyparki próżniowej) organicznego rozpuszczalnika w którym rozpuszczone zostały lipidy, do chwili otrzymania suchego filmu lipidowego. Następnie tak otrzymany film lipidowy uwadnia się za pomocą roztworu wodnego mieszając zawartość naczynia w temperaturze wyższej od temperatury przejścia fazowego użytych lipidów (A.D. Bangham, de Gier, & Greville, 1967). Metoda ta jest stosunkowo prosta i szeroko stosowana, największą jej wadą jest otrzymywanie liposomów (MLV) charakteryzujących się bardzo dużą polidyspersją. W związku z powyższym liposomy otrzymane tą techniką często poddawane są następnie kolejnym obróbkom w celu redukcji ich wielkości i polidyspersji. Najczęściej stosowanymi metodami pozwalającymi na otrzymanie mniejszych liposomów jest sonikacja (w celu otrzymywania SUV-ów) lub ekstruzja MLV przez filtry poliwęglanowe pozwalająca otrzymywać liposomy LUV charakteryzujące się bardzo niską polidyspersyjnością (Olson F, 1979). Dodatkowo (w połączeniu z ekstruzją) zastosowanie techniki FAT ( ang. freeze and thaw ) polegającej na szybkim zamrażaniu zawiesiny liposomów np. w ciekłym azocie i następnie rozmrażanie ich w temperaturze ok 60ᵒC pozwalajacej na zwiększenie objętości wodnej liposomów oraz redukcję ilości warstw lipidowych. (Costa, Xu, & Burgess, 2014).
2) Metoda odparowywania odwróconych faz (REV): metoda ta polega na emulgowaniu roztworu lipidów rozpuszczonych w rozpuszczalniku organicznym w roztworze wodnym a następnie odparowaniu rozpuszczalnika organicznego. Postępowanie to pozwala na otrzymanie liposomów typu LUV oraz OLV. Uzyskane liposomy charakteryzują się dużą objętością zamkniętego roztworu wodnego (Laouini A. et al., 2012).
3) Metoda wstrzykiwania roztworu etanolowego lub eterowego: metoda ta polega na wstrzyknięciu etanolowego lub eterowego roztworu lipidów do roztworu wodnego w wyniku czego następuje proces tworzenia pęcherzyków lipidowych. Metoda iniekcji roztworu etanolowego opisana została w 1973 roku, pozwala na otrzymanie liposomów charakteryzujących się bardzo niską polidyspersją i o rozmiarze około 100 nm bez jakiegokolwiek ich procesowania (Stano et al., 2004). Metoda wstrzykiwania eterowego roztworu lipidowego różni się od metody wstrzykiwania roztworu etanolowego tym, iż eter nie miesza się z wodą i jest z niej odparowywany. Metoda ta polega na wstrzyknięciu roztworu eterowego lipidów do gorącego roztworu wodnego w temperaturze wyższej niż temperatura wżenia eteru w wyniku czego eter ulega wyparowaniu i tworzą się jednowarstwowe pęcherzyki. Plusem tej metody jest pozbycie się rozpuszczalnika organicznego w porównaniu do metody opartej na etanolu przez co możliwe jest prowadzenie procesu ciągłego i otrzymanie stężonego roztworu liposomowego (Laouini A. et al., 2012). Obecnie opracowano szereg nowych metod opartych na metodzie wstrzykiwania etanolu takich jak np. metoda wstrzykiwania krzyżowego czy metoda mikrofluidyzacji. W metodzie wstrzykiwania krzyżowego Wagner et al. opisała sposób wytwarzania liposomów do celów farmaceutycznych. Metoda ta opiera się na krzyżowym połączeniu roztworu etanolowego lipidów oraz roztworu wodnego i ciągłego ich mieszania ze sobą w celu otrzymania liposomów (Wagner .A, 2006). Metoda mikrofluidyzacji opisał Jahn et al. , metoda ta polega na wstrzykiwaniu poprzez mikrokanały fazy wodnej i lipidowej. Kontrolując przepływ obu faz w mikrokanałach można otrzymywać liposomy o różnej wielkości.
4) Metoda dializy detergentowej: metoda ta pozwala na otrzymanie dużych jednowarstwowych liposomów. W pierwszej facie tworzy się mieszane micele złożone z detergentu i fosfolipidów. Następnie detergent jest stopniowo usuwany z roztworu za pomocą dializy a fosfolipidy tworzą homogenne liposomy. Wadą tej metody jest niewątpliwe zanieczyszczenie liposomów poprzez pozostałości detergentów.
Liposomy są obecnie jednym z wiodących iniekcyjnych systemów dostarczania leków, a dzięki swojej budowie mogą zamykać zarówno substancje hydrofilowe w hydrofilowym wodnym wnętrzu oraz hydrofobowe w hydrofobowej fosfolipidowej dwuwarstwie (patrz Ryc. 1.5.). Generalnie substancje czynne wewnątrz liposomów zamykane mogą być na dwa sposoby, pierwszy nazywany biernym lub pasywnym pozwala na enkapsulację substancji hydrofilowych jak i hydrofobowych w trakcie tworzenia pęcherzyków lipidowych oraz drugi sposób tzw. aktywny pozwalający na zamykanie substancji lipofilowych zawierających w swojej budowie chemicznej słabe grupy jonizowalne takie jak np. grupa aminowa lub karboksylowa (Gubernator, 2011). Metoda zamykania bezpośrednio wpływa na właściwości otrzymanego preparatu takie jak jego stabilność, wydajność zamykania (EE) czy stosunek lek/lipid (D/L). Wszystkie te parametry bezpośrednio wpływają na farmakokinetykę leku, jego stabilność oraz biodostępność a przez to na efekt terapeutyczny formulacji.
Sposoby zamykania substancji czynnych w liposomach
Zamykanie pasywne
Jak już wspomniano wcześniej pierwszą metodą pozwalającą na zamykanie substancji czynnych w liposomach jest metoda pasywna. W założeniu leki hydrofilowe rozpuszczone w roztworze uwadniającym zamykane są w hydrofilowym wnętrzu liposomów w trakcie tworzenia się pęcherzyków, natomiast substancje hydrofobowe dodane do filmu lipidowego (lub roztworu organicznego lipidów) są wbudowywane do dwuwarstwy w trakcie tworzenia się liposomów.
Dwuwarstwa lipidowa liposomów stanowi naturalną barierę dla wielu hydrofilowych dobrze rozpuszczalnych w wodzie substancji (taki jak np. cukry, peptydy, niektóre antybiotyki etc.) przez co mogą one być zamykane wewnątrz liposomów. Stabilność tak otrzymanych preparatów w dużej mierze zależy od składu lipidowego dwuwarstwy. Jednym z kluczowych parametrów wpływającym na stabilność leku, czyli jego wyciek z liposomów jest płynność dwuwarstwy lipidowej która w dużej mierze jest zależna od składu lipidowego. Lipidy z jakich zbudowana jest dwuwarstwa mają wpływ na to w jakiej fazie uporządkowania znajduje się ona w danej temperaturze. Liposomy których błona w niskich temperaturach (do 37 st. C) występuje w fazie ciekłokrystalicznej charakteryzuje się większą płynnością i przepuszczalnością błony dla substancji hydrofilowych w porównaniu do błony będącej w fazie żelowej. Wykazano, iż między innymi dodatek cholesterolu do składu lipidowego liposomów znacznie redukuje wyciek substancji hydrofilowych z ich wnętrza. Cholesterol redukuje możliwość swobodnej rotacji łańcuchów węglowodorowych fosfolipidów, co z kolei przekłada się na uporządkowanie molekularne dwuwarstwy i jej płynność oraz podwyższenie temperatury przejścia fazowego (Manojlovic et al., 2008). W przypadku niektórych bardzo hydrofilowych leków takich jak np. cisplatyna dodatek cholesterolu do dwuwarstwy tak skutecznie zatrzymywał lek wewnątrz liposomów, że lek nie mógł być efektywnie uwolniony, co z kolei przekładało się na słaby efekt biologiczny (Zamboni et al., 2004). Bardzo istotny wpływ na stabilność formulacji liposomów mają także hydrofobowe łańcuchy acylowe fosfolipidów. Długość oraz stopień nienasycenia łańcuchów węglowodorowych wpływa na uporządkowanie błony co z kolei przekłada się na jej płynność a to z kolei na jej właściwości barierowe dla substancji zamkniętych wewnątrz liposomów. Generalnie im krótsze oraz bardziej nienasycone są łańcuchy węglowodorowe tym dwuwarstwa lipidowa jest bardziej płynna oraz przepuszczalna, z drugiej strony im łańcuchy dłuższe i bardziej nasycone tym błona jest bardziej sztywna i mniej przepuszczalna (Moghaddam et al., 2011).
Mimo, iż formulacje liposomowe leków hydrofilowych zamykanych biernie charakteryzują się dużą stabilnością pod względem wycieku substancji czynnej z liposomów (a dodatkowo parametr ten może być w pewien sposób kontrolowany za pomocą składu lipidowego) mają one jedną zasadniczą wadę a mianowicie charakteryzują się one niską wydajnością zamykania substancji czynnych. W przypadku najprostszej metody pozwalającej na zamknięcie roztworów leków w liposomach a mianowicie metody cienkiego filmu lipidowego tylko około 5 do 20% substancji zostaje zamknięta , co przekłada się na niski stosunek leku do lipidu oraz znaczne straty materiału (Gubernator, 2011). Istotnym parametrem mającym wpływ na ilość zamkniętego leku wewnątrz liposomów w sposób pasywny jest objętość roztworu zamkniętego wewnątrz pęcherzyków. Aby ją zwiększyć należy przede wszystkim zmniejszyć lamelarność liposomów, w tym celu stosuje się szereg technik (Xu, Khan, & Burgess, 2012). Jak opisano w punkcie 1.2.1 wykorzystując technikę FAT można zmniejszyć lamelarność liposomów oraz zwiększyć penetrację leku do wnętrza liposomów. W swojej pracy Chapman et al. opisał szereg czynników mających wpływ na wydajność zamykania substancji czynnych w liposomach wśród których metoda FAT zwiększała wydajność zamykania substancji od około 10 do 50 razy (Chapman, Erdahl, Taylor, & Pfeiffer, 1990). Inną bardzo istotną techniką, która może poprawić wydajność zamykania substancji hydrofilowych jest preparacja liposomów metodą REV. Jak już opisano w wcześniejszym punkcie metoda ta pozwala na otrzymywanie liposomów typu LUV o wydajności zamykania substancji czynnych na poziomie 60-65% (Eloy J, 2014). W porównaniu z metodą FAT w przypadku zamykania 5-fluorouracylu technika REV pozwoliła na statystycznie większą wydajność zamykania leku, jednakże otrzymane liposomy charakteryzowały się dużą heterogennością pod względem rozmiaru (Elorza, Elorza, Frutos, & Chantres, 1993). Niewątpliwym minusem metody REV jest pozostałość resztek rozpuszczalnika użytego do rozpuszczania lipidów co może ją dyskredytować do zastosowania praktycznego (Gubernator, 2011). Inną metodą pozwalającą na zwiększenie wydajności zamykania leków jest metoda dehydratacji-hydratacji (DRV). Metoda ta pozwala na otrzymanie forumlacji charakteryzującej się wysokim stosunkiem lek/lipid i polega na uwodnieniu uprzednio zliofilizowanych liposomów bezpośrednio przed użyciem (Mugabe, Azghani, & Omri, 2006). W przypadku wankomycyny metoda ta pozwalała na zamknięcie większej ilości leku nie tylko w porównaniu do metody TFH ale także w porównaniu do metody aktywnego zamykania (Muppidi, Pumerantz, Wang, & Betageri, 2012). Parametrem pozwalającym na zwiększenie wydajności zamykania substancji może być odziaływanie naładowanej błony z lekiem posiadającym inny ładunek. Zależność taką wykazano między innymi dla gancykloviru, gdzie liposomy EPC:Chol zawierające stearyloaminę charakteryzowały się zdecydowanie większą wydajnością zamykania w porównaniu do liposomów bez ładunku (Kajiwara et al., 2007).
Podsumowując, bierne zamykanie leku wewnątrz liposomów charakteryzuje się nie do końca zadawalającą wydajnością zamykania, oraz słabym stosunkiem lek/lipid. Czyni to metodę pasywnego zamykania daleką od ideału, co wymusiło na naukowcach opracowanie bardziej efektywnych metod zamykania substancji czynnych.
Zamykanie aktywne
Wykorzystanie zamykania (ładowania) aktywnego leku do wnętrza liposomów wychdzi naprzeciw problemom związanym z zamykaniem pasywnym i pozwala na otrzymanie stabilnych formulacji liposomowych charakteryzujących się bardzo wysoką wydajnością zamykania oraz bardzo dobrym stosunkiem lek/lipid. Metoda ta pierwszy raz została opisana przez Deamera i współpracowników którzy opisali zamykanie aktywne wewnątrz liposomów katecholoamin (Nichols J. & Deamer D., 1976). Różnica pH po obu stronach dwuwarstwy lipidowej jest w tej metodzie siłą napędową i może być wygenerowana albo poprzez podniesienie pH buforu zewnętrznego za pomocą zasady lub w dwu etapowym procesie, w którym w pierwszym przygotowywane są liposomy w roztworze o określonym pH a w drugim następuje wymiana roztworu zewnętrznego (np. za pomocą filtracji żelowej) na bufor o innym pH (Ishida, Takanashi, Doi, Yamamoto, & Kiwada, 2002; Lipka et al., 2013). Medoda aktywnego ładowania leków opiera się na zjawisku różnej przepuszczalnośći dwuwarstwy dla lipofilowych cząsteczek w zależności od ich stanu jonizacji. Dla słabych zasad w pH obojętnym nienaładowane cząsteczki leku mogą swobodnie dyfundować w poprzek dwuwarstwy lipidowej natomiast w środku pęcherzyka w niskim pH następuje ich protonacja, która uniemożliwia ich wyciek na zewnątrz. Aby ów proces mógł zajść substancje czynne muszą spełniać pewne strukturalne wymagania takie jak: wartość logP w pH 7 powinna być w przedziale -2.5 do 2.0, a pKa ≤11 oraz związek musi być przynajmniej w małym stopniu rozpuszczalny w wodzie (Clerc & Barenholz, 1998; Zucker, Marcus, Barenholz, & Goldblum, 2009). Jak wspomniano warunki takie spełniają miedzy innymi słabe zasady organiczne. Związki te w pH ÷ 7 występują zarówno w stanie naładowany (uprotonowanym) jak i obojętnym, natomiast wraz ze spadkiem pH równowaga zaczyna przesuwać się w kierunku cząstek naładowanych, natomiast w przypadku wzrostu pH w kierunku cząstek obojętnych. Dla wielu słabych zasad już w przypadku pH 4.0 większość cząstek jest obdarzonych ładunkiem co powoduje iż nie mogą one swobodnie dyfundować w poprzek błony. Większość antracyklin które są słabymi zasadami w roztworach wodnych występuje w równowadze pomiędzy formą uprotonowaną a obojętną, i tylko forma obojętna może penetrować dwuwarstwe lipidową. W momencie gdy wnika ona do wnętrza liposmów o niskim pH, następuje jej „uwięzienie” w jego wnętrzu, przy czym po zewnętrznej stronie liposomu następuje przesunięcie równowagi dysocjacji antracyklin ku formie obojętnej która w wyniku swobodnego przepływu w poporzek dwuwarstwy akumuluje się w liposomach.
Pierwszą metodą pozwalając na aktywne zamykanie leków opracowana przez Bally i współpracowników opierała się na gradiencie 300 mM buforu cytrynianowego wymienionego na bufor HEPES o pH 7.4 (Bally et al., 1988; Mayer, Bally, Hope, & Cullis, 1985). Metoda ta pozwalała na akumulację w liposomach słabych zasad aminowych jakimi były antybiotyki z grupy antracyklin takie jak doksorubicyna , daunorubicyna czy idarubicyna z bardzo dużą wydajnością (EE wynosiła prawie 100%) przy bardzo korzystnym stosunku lek/lipid (0.3 w/w). Dodatkowo zaobserwowano, iż w przypadku antracyklin w liposomach tworzą się struktury trudno rozpuszczalnych soli cytrynianu leku, które nadają liposomom kształt podobny do ziarenek kway (ang. coffee bean liposomes). Otrzymane formulacje liposomowe charakteryzowały się wysoko stabilnością in vitro szczególnie gdy do budowy liposomów użyto lipid o wysokiej temperaturze przejścia fazowego taki jak disterylofofatydylocholina (DSPC) czy uwodorniona lecytyna (HSPC). Gradient cytrynianowy został z powodzeniem zastosowany w komercyjnych liposomowych preparatach takich jak Myocet® (Enzon Pharamaceuticals) zawierający Doksorubicyne oraz DaunoXome® (Nextar Pharamaceuticals) (Batist, Barton, Chaikin, Swenson, & Welles, 2002; Forssen, 1997).
Następnym krokiem milowym związanym z zamykaniem aktywnym leków wewnątrz w liposomach było opracowanie przez Barenholza metody opartej na gradiencie siarczanu amonu. Siłą napędową pozwalająca na zamykanie słabych zasad w metodzie tej jest różnica w stężeniach siarczanu amonu w poprzek dwuwarstwy lipidowej. W praktyce wygląda to tak,,że wewnątrz liposomów znajduje się 300 mM roztwór siarczanu amonu o pH o5.5 natomiast na zewnątrz liposomów bufor o pH około 7.4. Cząsteczki amoniaku, które powstają w wyniku hydrolizy jonu amonowego mogą swobodnie dyfundować w poprzek dwuwarstwy lipidowej zgodnie z gradientem stężeń pozostawiając po sobie proton który generuje gradient pH zakwaszając środowisko wewnątrz liposomów (dwuwarstwa lipidowa jest praktycznie nieprzepuszczalna dla jonów siarczanowych i jonów wodowrowych patrz Ryc. 1.7) .Tak wygenerowany gradient pozwala na bardzo wydajne zamykanie antracyklin, a wydajność tego procesu jest proporcjonalna od stosunku stężenia jonów amonowych na zewnątrz liposomów do stężenie jonów amonowych wewnątrz liposomów [NH4+]zew/[NH4+]lip. Wyciek amoniaku z liposomów powoduje zakwaszenie ich środowiska wewnętrznego co z kolei przesuwa reakcję hydrolizy do amoniaku do jonów amonowych. Natomiast wnikanie do wnętrza liposomów słabych zasad nie obdarzonych ładunkiem powoduje ich protonację oraz podwyższenie pH, co z kolei podwyższa pH wewnątrz liposomów przesuwając równowagę reakcji hydrolizy siarczanu amonu w kierunku amoniaku. Dzięki temu zjawisku metoda ta pozwala na zamykanie z bardzo dużą wydajnością leku (EE>95%) przy stosunku lek/lipid nawet 0.3 czy nawet 0.4. Niewątpliwą zaletą tej metody jest także brak potrzeby wytwarzania liposomów w niskim pH dzięki generowanemu samoistnie gradientowi (Haran, Cohen, Bar, & Barenholz, 1993). W metodzie tej lek wewnątrz liposomów zamykany jest nie tylko dlatego, iż ulega protonacji ale dodatkowo powstaje trudno rozpuszczalny kompleks pomiędzy siarczanem a antracyklinami. Proces ten został schematycznie przedstawiony na Ryc. 1.8. W przypadku doksorubicyny powstały kompleks jest około trzy razy słabiej rozpuszczalny niż odpowiedni kompleks z cytrynianem w przedziale pH od około 4.0 do 7.5 (Fritze, Hens, Kimpfler, Schubert, & Peschka-Suss, 2006). Formulacje doksorubicyny opartej na gradiencie siarczanu amonu charakteryzują się doskonałą stabilność zarówno in vitro jak i in vivo a ich parametry farmakokinetyczne oraz farmakodynamiczne są nieporównywalnie lepsze w porównaniu z wolnym lekiem. Co więcej, metoda zamykania aktywnego leku opartego na siarczanie amonu pozwoliła na opracowanie Doxil’u® pierwszego leku zamkniętego w nanoliposomach dopuszczonego przez FDA. Zastosowanie liposomów jako nośnika w Doxil’u® pozwoliło na opracowanie preparatu charakteryzującego się zdecydowanie mniejszymi skutkami ubocznymi takimi jak miedzy innymi kardiotoksyczność w porównaniu z wolnym lekiem dzięki wykorzystaniu biernego ukierunkowania wynikającego z efektu EPR (Barenholz, 2012). Niestety poza zmniejszeniem efektów ubocznych Doxil® nie spełnił pokładanych w nim nadziei związanych z zwiększeniem efektu terapeutycznego. Najprawdopodobniej największa zaleta Doxilu® czyli jego stabilność jest także po części jego wadą gdyż powoduje niską dostępność leku. Barenholz w swojej pracy opisującej historię rozwoju Doxilu postuluje tezę, iż tylko lek w postaci monomerycznej oddziałuje z DNA, natomiast uwalnianie wolnego leku z liposomów, w których tworzy on trudno rozpuszczalny kompleks może być zbyt wolne co niestety wpływa na jego dostępność i aktywność (Barenholz, 2012).
Metoda aktywnego zamykania doksorubicyny oparta na gradiencie siarczanu amonu. 2D-NHCl – chlorowodorek doksorubicyny ; D-NH+ - uprotonowana doksorubicyna; D-N – obojętną doksorubicyna; (D-NH2)SO4 trudno rozpuszczalny kompleks doksorubicyny i siarczanu amonu
Oprócz siarczanu amonu w 2006 roku Fritze et al. przebadała także wpływ innych soli amonowych takich jak cytrynian, octan oraz fosoforan na zamykanie jak i uwalnianie doksorubicyny z liposomów. Wykazała ona, iż nie tylko siarczan amonu ale też pozostałe sole amonowe pozwalają na wydajne zamykanie leku z dużą wydajnością (EE w przypadku użycia cytrynianu = ~100%, fosforanu 98,5%, siarczanu 95% a octanu 77%). Bardzo istotnym wynikiem było również wykazanie, iż w przypadku leku zamykanego za pomocą fosforanu amonu w warunkach niskiego pH (5.5) następuje zdecydowane szybsze uwalnianie doksorubicyny w porównaniu do formulacji opartej na siarczanie amonu, przy czym rozpuszczalność kompleksu fosforan-doksorubicyna w pH 5.0 było około dwukrotnie większe od kompleksu siarczan-doksorubicyna co może świadczyć iż istnieje związek pomiędzy dostępnością leku zamkniętego w liposomach a jego rozpuszczalnością. Warte zaznaczenia jest, że to iż formulacje oparte na fosforanie amonu charakteryzowały się bardzo wysoką stabilnością podczas przechowywania co świadczy o tym, iż wyciek leku stymulowany był w tym przypadku zmianą pH (Fritze et al., 2006).
Jeszcze innym sposobem pozwalającym na zamykanie słabych zasad w liposomach było wykorzystanie gradientu jonów metali przejściowych tj. siaczanów oraz chlorków manganu lub miedzi. Abrahama et al. w 2004 roku gradient siarczanu i chlorku managanu w kombinacji z gradientem pH z wcześniej opisanymi metodami czy metodą gradientu cytrynianowego oraz siarczanu amonu zamykając w liposomach topotekan. Wszystkie metody zapewniały akumulacje leku w liposomach jednakże w przypadku gradientu opartego jonach manganu zaobserwowano mniejszą wydajność zamykania, szczególnie przy wysokim stosunku lek:lipid. Wykorzystując gradient oparty na jonach miedzi w postaci soli siarczanowej oraz chlorkowej Li et al. Zamknął w liposomach miktoksantron, silnie hydrofilową antracyklinę. Opracowana metoda pozwalała zamykać lek z dużą wydajnością przy czym formulacją oparta na chlorku miedzi (II) charakteryzowała się mniejszą stabilnością in vitro w porównaniu do formulacji opartej na siarczanie miedzi (II). Co bardzo ciekawe mimo mniejszej stabilności formulacja oparta na chlorku charakteryzowała się większą aktywnością terapeutyczną, co najprawdopodobniej wiązało się ze stanem fizycznym leku wewnątrz liposomów. Ciekawym wydaje się również to, iż w przypadku mitoksantronu nie obserwowano powstawania trudno rozpuszczalnego osadu wewnątrz liposomów a mimo tego formulacje charakteryzowały się wysoką stabilnością (C. Li et al., 2008).
W przypadku mało lipofilowych antracyklin takich jak mitoksantron lub średnio lipofilowych takich jak np. doksorubicyna czy epirubicyna wydaje się, że tworzenie trudno rozpuszczalnych soli podczas zamykania leku wewnątrz liposomów nie jest konieczne a wręcz przeciwnie czasem może zmniejszyć jego biodostępność. W przypadku ww. antracyklin już sama błona lipidowa w charakteryzująca się wysoką temperaturą przejścia fazowego stanowi istotną barierę dla leku. Natomiast w przypadku idarubicyny będącej silnie lipofilową antracykliną sytuacja wygląd wręcz przeciwnie. Zastosowanie gradientu czy to siarczanu amonu czy cytrynianowego powoduje bardzo szybką akumulacje leku wewnątrz liposomów nawet poniżej temperatury przejścia fazowego błony lipidowej oraz z drugiej strony bardzo szybki wyciek leku z liposomów (Gubernator et al., 2010; Slifirski, Szelejewski, Grynkiewicz, Gubernator, & Kozubek, 2003). Dodatkowo odziaływania leku z cholesterolem przyspieszają jego wyciek destabilizując cały układ. Santos et al. opracowała formulacje Idarubicyny zamkniętej w liposomach które nie zawierały cholesterolu oraz z mniejszą ilością pegylowanej fosfatydyloetanoloaminy otrzymując w ten sposób formulację chrakteryzującą się lepszymi parametrami farmakokinetycznymi w porównaniu do formulacji zawierającej cholesterol, (Dos Santos et al., 2002). Innowacyjne rozwiązanie pozwalające na otrzymanie stabilnej liposomalnej formulacji idarubicyny zaproponował Guberantor et al. Wykorzystując gradient wersenianu amonu. Opracowana formulacją oparta była na tworzeniu trudno rozpuszczalnych soli pomiędzy EDTA a idarubicyną, znacznie słabiej rozpuszczalnych aniżeli sole siarczanowe czy też cytrynianowe. Opracowana formulacją charakteryzowała się nie tylko wysoką stabilnością in vitro ale także zdecydowanie lepszymi parametrami farmakokinetycznymi w porównaniu do formulacji opartej na liposomach niezawierających cholesterolu (Gubernator et al., 2010). Gradient wersenianowy z powodzeniem zastosowano także w przypadku mniej lipofilowych antracyklin takich jak epirubicyna otrzymując stabilne formulacje zarówno in vitro i in vivo oraz o bardzo korzystnym efektem terapeutycznym (Gubernator et al., 2014).